Перейти до вмісту

Флуорофор

Матеріал з Вікіпедії — вільної енциклопедії.
(Перенаправлено з Флюорофор)
Мічена флуорофором клітина людини.

Флуорофор (або флуорохром, подібно до хромофора ) — це флуоресцентна хімічна сполука, яка може повторно випромінювати світло під час світлового збудження. Флуорофори зазвичай містять кілька комбінованих ароматичних груп або планарних або циклічних молекул з кількома π-зв’язками. [1]

Флуорофори іноді використовуються окремо, як індикатори в рідинах, як барвник для фарбування певних структур, як субстрат для ферментів або як зонд чи індикатор (коли на його флуоресценцію впливають такі аспекти середовища, як полярність або іони). У більш загальному випадку вони ковалентно зв’язані з макромолекулами, слугуючи маркерами (або барвниками, або мітками, або репортерами) для афінних або біоактивних реагентів ( антитіл, пептидів, нуклеїнових кислот). Флуорофори, зокрема, використовуються для фарбування тканин, клітин або матеріалів у різноманітних аналітичних методах, таких як флуоресцентне зображення та спектроскопія.

Флуоресцеїн через його аміноактивну ізотіоціанатну похідну флуоресцеїн ізотіоціанат (FITC) був одним із найпопулярніших флуорофорів. Від мічення антитіл застосування поширилося на нуклеїнові кислоти завдяки карбоксифлуоресцеїну. Іншими історично поширеними флуорофорами є похідні родаміну (TRITC), кумарину та ціаніну. [2] Новіші покоління флуорофорів, багато з яких є запатентованими, часто працюють краще, будучи більш фотостабільними, яскравішими або менш чутливими до рН, ніж традиційні барвники з порівнянним збудженням і випромінюванням. [3] [4]

Флуоресценція

[ред. | ред. код]

Флуорофор поглинає світлову енергію певної довжини хвилі та повторно випромінює світло з більшою довжиною хвилі. Поглинені довжини хвилі, ефективність передачі енергії та час до випромінювання залежать як від структури флуорофора, так і від його хімічного середовища, оскільки молекула у своєму збудженому стані взаємодіє з навколишніми молекулами. Довжини хвилі максимального поглинання (≈ збудження) і випромінювання (наприклад, поглинання/випромінювання = 485 нм/517 нм) є типовими термінами, що використовуються для позначення даного флуорофора, але весь спектр може бути важливим для розгляду. Спектр довжини хвилі збудження може бути дуже вузькою або ширшою смугою, або весь спектр може перевищувати межу. Спектр випромінювання зазвичай гостріший, ніж спектр збудження, і має більшу довжину хвилі та, відповідно, меншу енергію. Енергія збудження коливається від ультрафіолетового до видимого спектра, а енергія випромінювання може тривати від видимого світла до ближньої інфрачервоної області.

Основними характеристиками флуорофорів є:

  • Максимальна довжина хвилі збудження та випромінювання (виражена в нанометрах (нм)): відповідає піку в спектрах збудження та випромінювання (зазвичай по одному піку в кожному).
  • Молярний коефіцієнт поглинання (у моль -1 см -1 ): пов'язує кількість поглиненого світла на даній довжині хвилі з концентрацією флуорофора в розчині.
  • Квантовий вихід : ефективність енергії, що передається від падаючого світла до випромінюваної флуоресценції (кількість випущених фотонів на поглинений фотон).
  • Тривалість життя (у пікосекундах): тривалість збудженого стану флуорофора до повернення в основний стан. Це стосується часу, необхідного для розпаду популяції збуджених флуорофорів до 1/ e (≈0,368) від початкової кількості.
  • Стоксів зсув : різниця між максимальною довжиною хвилі збудження та максимальною емісією.
  • Темна фракція : частка молекул, неактивних у випромінюванні флуоресценції. Для квантових точок тривала одномолекулярна мікроскопія показала, що 20-90% усіх частинок ніколи не випромінюють флуоресценцію. [5] З іншого боку, кон’юговані полімерні наночастинки (Pdots) майже не демонструють темної фракції у своїй флуоресценції. [6] Флуоресцентні білки можуть мати темну фракцію через неправильне згортання білка або дефектне утворення хромофора. [7]

Ці характеристики обумовлюють інші властивості, включаючи фотовідбілювання або фотостійкість (втрата флуоресценції при постійному збудженні світлом). Необхідно враховувати й інші параметри, як-от полярність молекули флуорофора, розмір і форму флуорофора (тобто для картини поляризаційної флуоресценції ) та інші фактори можуть змінити поведінку флуорофорів.

Флуорофори також можна використовувати для гасіння флуоресценції інших флуоресцентних барвників або для передачі їх флуоресценції на навіть довших хвилях.

Більшість флуорофорів є невеликими органічними молекулами з 20–100 атомів (200–1000 Дальтон ; молекулярна маса може бути вищою залежно від модифікацій щеплення та кон’югованих молекул), але є також набагато більші природні флуорофори, які є білками : зелений флуоресцентний білок (GFP) становить 27 кДа, а кілька фікобіліпротеїнів (PE, APC...) мають ≈240 кДа. Станом на 2020 рік найменший відомий флуорофор вважався 3-гідроксіізонікотинальдегідом, сполукою з 14 атомів і лише 123 Да. [8]

Флуоресцентні частинки, як квантові точки (2–10 діаметр нм, 100–100 000 атомів) також вважаються флуорофорами. [9]

Розмір флуорофора може стерично перешкоджати міченій молекулі та впливати на полярність флуоресценції.

Сім'ї

[ред. | ред. код]
Флуоресценція різних речовин під ультрафіолетовим світлом. Зелений — флуоресцеїн, червоний — родамін В, жовтий — родамін 6G, синій — хінін, фіолетовий — суміш хініну та родаміну 6 г. Розчини мають концентрацію приблизно 0,001% у воді.

Молекули флуорофора можуть бути використані окремо або служити флуоресцентним мотивом функціональної системи. На основі молекулярної складності та синтетичних методів молекули флуорофора можна загалом класифікувати на чотири категорії: білки та пептиди, невеликі органічні сполуки, синтетичні олігомери та полімери та багатокомпонентні системи. [10] [11]

Флуоресцентні білки GFP, YFP і RFP (зелений, жовтий і червоний відповідно) можуть бути приєднані до інших специфічних білків з утворенням злитого білка, який синтезується в клітинах після трансфекції відповідного плазмідного носія.

Небілкові органічні флуорофори належать до наступних основних хімічних груп:

Ці флуорофори флуоресцюють завдяки делокалізованим електронам, які можуть стрибати через смугу та стабілізувати поглинену енергію. Наприклад, бензол, один із найпростіших ароматичних вуглеводнів, збуджується при 254 нм і випромінює на 300 нм. [12] Це відрізняє флуорофори від квантових точок, які є флуоресцентними наночастинками напівпровідника.

Вони можуть бути приєднані до білків до певних функціональних груп, таких як аміногрупи ( активний ефір, карбоксилат, ізотіоціанат, гідразин ), карбоксильні групи ( карбодиімід ), тіол ( малеімід, ацетилбромід ) і органічний азид (через клацальну хімію або не- зокрема ( глутаровий альдегід )).

Крім того, можуть бути присутні різні функціональні групи, що змінюють їхні властивості, наприклад розчинність, або надають особливі властивості, наприклад борна кислота, яка зв’язується з цукрами, або кілька карбоксильних груп для зв’язування з певними катіонами. Якщо барвник містить електронодонорну та електроноакцепторну групи на протилежних кінцях ароматичної системи, цей барвник, ймовірно, буде чутливим до полярності навколишнього середовища ( сольватохромний ), тому його називають чутливим до середовища. Часто барвники використовуються всередині клітин, які непроникні для заряджених молекул; в результаті цього карбоксильні групи перетворюються в складний ефір, який видаляється естеразами всередині клітин, наприклад, фура-2АМ і флуоресцеїн-діацетат.

Наступні родини барвників є групами торгових марок і не обов’язково мають структурну подібність.

  • CF барвник (біотій)
  • Зонди DRAQ і CyTRAK ( BioStatus )
  • BODIPY ( Invitrogen )
  • EverFluor (Setareh Biotech)
  • Alexa Fluor (Invitrogen)
  • Bella Fluor (Setareh Biotech)
  • DyLight Fluor (Thermo Scientific, Pierce)
  • Атто і Трейсі ( Сігма Олдріх )
  • FluoProbes ( Інтерхім )
  • Барвники Abberior (Абберіор)
  • Барвники DY та MegaStokes (Dyomics)
  • Барвники Sulfo Cy (Cyandye)
  • HiLyte Fluor (AnaSpec)
  • Барвники Seta, SeTau і Square (SETA BioMedicals)
  • Барвники Quasar і Cal Fluor ( Biosearch Technologies )
  • Барвники SureLight ( APC, RPE PerCP, Phycobilisomes ) (Columbia Biosciences)
  • APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
  • Vio Dyes (Miltenyi Biotec)
Ядра ендотеліальних клітин легеневої артерії великої рогатої худоби пофарбовані в синій колір за допомогою DAPI, мітохондрії пофарбовані в червоний колір за допомогою MitoTracker Red CMXRos і F-актин пофарбовані в зелений колір за допомогою фаллоідіну Alexa Fluor 488 і зображені на флуоресцентному мікроскопі.

Приклади часто зустрічаються флуорофорів

[ред. | ред. код]

Реактивні та кон'юговані барвники

[ред. | ред. код]
Dye Ex (nm) Em (nm) MW Notes
Hydroxycoumarin 325 386 331 Succinimidyl ester
Aminocoumarin 350 445 330 Succinimidyl ester
Methoxycoumarin 360 410 317 Succinimidyl ester
Cascade Blue(інші мови) (375);401 423 596 Hydrazide
Pacific Blue 403 455 406 Maleimide
Pacific Orange 403 551
3-Hydroxyisonicotinaldehyde 385 525 123 QY 0.15; pH sensitive
Lucifer yellow 425 528
NBD 466 539 294 NBD-X
R-Phycoerythrin (PE) 480;565 578 240 k
PE-Cy5 conjugates 480;565;650 670 aka Cychrome, R670, Tri-Color, Quantum Red
PE-Cy7 conjugates 480;565;743 767
Red 613 480;565 613 PE-Texas Red
PerCP 490 675 35kDa Peridinin chlorophyll protein
TruRed 490,675 695 PerCP-Cy5.5 conjugate
FluorX 494 520 587 (GE Healthcare)
Fluorescein 495 519 389 FITC; pH sensitive
BODIPY-FL 503 512
G-Dye100 498 524 suitable for protein labeling and electrophoresis
G-Dye200 554 575 suitable for protein labeling and electrophoresis
G-Dye300 648 663 suitable for protein labeling and electrophoresis
G-Dye400 736 760 suitable for protein labeling and electrophoresis
Cy2 489 506 714 QY 0.12
Cy3 (512);550 570;(615) 767 QY 0.15
Cy3B 558 572;(620) 658 QY 0.67
Cy3.5 581 594;(640) 1102 QY 0.15
Cy5 (625);650 670 792 QY 0.28
Cy5.5 675 694 1272 QY 0.23
Cy7 743 767 818 QY 0.28
TRITC 547 572 444 TRITC
X-Rhodamine 570 576 548 XRITC
Lissamine Rhodamine B(інші мови) 570 590
Texas Red 589 615 625 Sulfonyl chloride
Allophycocyanin (APC) 650 660 104 k
APC-Cy7 conjugates 650;755 767 Far Red

Скорочення:

Нуклеїнові кислотні барвники

[ред. | ред. код]
Dye Ex (nm) Em (nm) MW Notes
Hoechst 33342 343 483 616 AT-selective
DAPI 345 455 AT-selective
Hoechst 33258 345 478 624 AT-selective
SYTOX Blue 431 480 ~400 DNA
Chromomycin A3 445 575 CG-selective
Mithramycin 445 575
YOYO-1 491 509 1271
Ethidium Bromide 210;285 605 394 in aqueous solution
GelRed 290;520 595 1239 Non-toxic substitute for Ethidium Bromide
Acridine Orange 503 530/640 DNA/RNA
SYTOX Green 504 523 ~600 DNA
TOTO-1, TO-PRO-1 509 533 Vital stain, TOTO: Cyanine Dimer
TO-PRO: Cyanine Monomer
Thiazole Orange(інші мови) 510 530
CyTRAK Orange 520 615 - (Biostatus) (red excitation dark)
Propidium Iodide (PI) 536 617 668.4
LDS 751 543;590 712;607 472 DNA (543ex/712em), RNA (590ex/607em)
7-AAD 546 647 7-aminoactinomycin D, CG-selective
SYTOX Orange 547 570 ~500 DNA
TOTO-3, TO-PRO-3 642 661
DRAQ5 600/647 697 413 (Biostatus) (usable excitation down to 488)
DRAQ7 599/644 694 ~700 (Biostatus) (usable excitation down to 488)

Барвники для функції клітин

[ред. | ред. код]
Барвник Ex (нм) Em (нм) МВт Примітки
Індо-1 361/330 490/405 1010 Естер AM, низький/високий вміст кальцію (Ca 2+ )
Флуо-3 506 526 855 AM естер. pH > 6
Флуо-4 491/494 516 1097 AM естер. pH 7,2
DCFH 505 535 529 2'7'Дихородигідрофлуоресцеїн, окислена форма
DHR 505 534 346 Дигідрородамін 123, окислена форма, світло каталізує окислення
SNARF 548/579 587/635 pH 6/9

Флуоресцентні білки

[ред. | ред. код]
Dye Ex (nm) Em (nm) MW QY BR PS Notes
GFP (Y66H mutation) 360 442
GFP (Y66F mutation) 360 508
EBFP 380 440 0.18 0.27 monomer
EBFP2 383 448 20 monomer
Azurite 383 447 15 monomer
GFPuv 385 508
T-Sapphire 399 511 0.60 26 25 weak dimer
Cerulean 433 475 0.62 27 36 weak dimer
mCFP 433 475 0.40 13 64 monomer
mTurquoise2 434 474 0.93 28 monomer
ECFP 434 477 0.15 3
CyPet 435 477 0.51 18 59 weak dimer
GFP (Y66W mutation) 436 485
mKeima-Red 440 620 0.24 3 monomer (MBL)
TagCFP 458 480 29 dimer (Evrogen)
AmCyan1 458 489 0.75 29 tetramer, (Clontech)
mTFP1 462 492 54 dimer
GFP (S65A mutation) 471 504
Midoriishi Cyan 472 495 0.9 25 dimer (MBL)
Wild Type GFP 396,475 508 26k 0.77
GFP (S65C mutation) 479 507
TurboGFP 482 502 26 k 0.53 37 dimer, (Evrogen)
TagGFP 482 505 34 monomer (Evrogen)
GFP (S65L mutation) 484 510
Emerald 487 509 0.68 39 0.69 weak dimer, (Invitrogen)
GFP (S65T mutation) 488 511
EGFP 488 507 26k 0.60 34 174 weak dimer, (Clontech)
Azami Green 492 505 0.74 41 monomer (MBL)
ZsGreen1 493 505 105k 0.91 40 tetramer, (Clontech)
TagYFP 508 524 47 monomer (Evrogen)
EYFP 514 527 26k 0.61 51 60 weak dimer, (Clontech)
Topaz 514 527 57 monomer
Venus 515 528 0.57 53 15 weak dimer
mCitrine 516 529 0.76 59 49 monomer
YPet 517 530 0.77 80 49 weak dimer
TurboYFP 525 538 26 k 0.53 55.7 dimer, (Evrogen)
ZsYellow1 529 539 0.65 13 tetramer, (Clontech)
Kusabira Orange 548 559 0.60 31 monomer (MBL)
mOrange 548 562 0.69 49 9 monomer
Allophycocyanin (APC) 652 657.5 105 kDa 0.68 heterodimer, crosslinked
mKO 548 559 0.60 31 122 monomer
TurboRFP 553 574 26 k 0.67 62 dimer, (Evrogen)
tdTomato 554 581 0.69 95 98 tandem dimer
TagRFP 555 584 50 monomer (Evrogen)
DsRed monomer 556 586 ~28k 0.1 3.5 16 monomer, (Clontech)
DsRed2 ("RFP") 563 582 ~110k 0.55 24 (Clontech)
mStrawberry 574 596 0.29 26 15 monomer
TurboFP602 574 602 26 k 0.35 26 dimer, (Evrogen)
AsRed2 576 592 ~110k 0.21 13 tetramer, (Clontech)
mRFP1 584 607 ~30k 0.25 monomer, (Tsien lab)
J-Red 584 610 0.20 8.8 13 dimer
R-phycoerythrin (RPE) 565 >498 573 250 kDa 0.84 heterotrimer[13]
B-phycoerythrin (BPE) 545 572 240 kDa 0.98 heterotrimer[13]
mCherry 587 610 0.22 16 96 monomer
HcRed1 588 618 ~52k 0.03 0.6 dimer, (Clontech)
Katusha 588 635 23 dimer
P3 614 662 ~10,000 kDa phycobilisome complex[13]
Peridinin Chlorophyll (PerCP) 483 676 35 kDa trimer[13]
mKate (TagFP635) 588 635 15 monomer (Evrogen)
TurboFP635 588 635 26 k 0.34 22 dimer, (Evrogen)
mPlum 590 649 51.4 k 0.10 4.1 53
mRaspberry 598 625 0.15 13 monomer, faster photobleach than mPlum
mScarlet 569 594 0.70 71 277 monomer[14]

Скорочення:

Додатки

[ред. | ред. код]
Докладніше: Флуоресценція в біологічних дослідженнях

Флуорофори мають особливе значення в галузі біохімії та дослідження білка, наприклад, в імунофлуоресценції, клітинному аналізі, [15] імуногістохімії [3] [16] і датчиках малих молекул. [17] [18]

Використання поза науками про життя

[ред. | ред. код]
Флуоресцентний морський барвник

Флуоресцентні барвники знаходять широке застосування в промисловості під назвою «неонові кольори», такі як:

  • Розширені косметичні формули
  • Засоби захисту та одяг
  • Органічні світлодіоди (OLED)
  • Образотворче мистецтво та дизайн (плакати та живопис)
  • Використання багатотонних накипів у фарбуванні текстилю та оптичних відбілювачів у пральних засобах
  • Барвники в хайлайтерах для створення ефекту блиску
  • Сонячні панелі для збору більшої кількості світла/довжин хвиль
  • Флуоресцентний морський барвник використовується, щоб допомогти повітряним пошуково-рятувальним командам знаходити об'єкти у воді

Дивіться також

[ред. | ред. код]

Список літератури

[ред. | ред. код]
  1. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). Chapter 3 Dyes and Fluorochromes. Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. с. 61—95. ISBN 978-1-68108-519-7. {{cite book}}: |access-date= вимагає |url= (довідка)
  2. ↑ Rietdorf J (2005). Microscopic Techniques. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology. Berlin: Springer. с. 246—9. ISBN 3-540-23698-8. Процитовано 13 грудня 2008.
  3. ↑ а б Tsien RY; Waggoner A (1995). Fluorophores for confocal microscopy. У Pawley JB (ред.). Handbook of biological confocal microscopy. New York: Plenum Press. с. 267—74. ISBN 0-306-44826-2. {{cite book}}: |access-date= вимагає |url= (довідка)
  4. ↑ Lakowicz, JR (2006). Principles of fluorescence spectroscopy (вид. 3rd). Springer. с. 954. ISBN 978-0-387-31278-1.
  5. ↑ Pons T, Medintz IL, Farrell D, Wang X, Grimes AF, English DS, Berti L, Mattoussi H (2011). Single-molecule colocalization studies shed light on the idea of fully emitting versus dark single quantum dots. Small. 7 (14): 2101—2108. doi:10.1002/smll.201100802. PMID 21710484.
  6. ↑ Koner AL, Krndija D, Hou Q, Sherratt DJ, Howarth M (2013). Hydroxy-terminated conjugated polymer nanoparticles have near-unity bright fraction and reveal cholesterol-dependence of IGF1R nanodomains. ACS Nano. 7 (2): 1137—1144. doi:10.1021/nn3042122. PMC 3584654. PMID 23330847.
  7. ↑ Garcia-Parajo MF, Segers-Nolten GM, Veerman JA, Greve J, van Hulst NF (2000). Real-time light-driven dynamics of the fluorescence emission in single green fluorescent protein molecules. PNAS. 97 (13): 7237—7242. Bibcode:2000PNAS...97.7237G. doi:10.1073/pnas.97.13.7237. PMC 16529. PMID 10860989.
  8. ↑ Cozens, Tom (16 грудня 2020). Fluorescent molecule breaks size record for green-emitting dyes. chemistryworld.com. Процитовано 3 грудня 2021.
  9. ↑ Li Z, Zhao X, Huang C, Gong X (2019). Recent advances in green fabrication of luminescent solar concentrators using nontoxic quantum dots as fluorophores. J. Mater. Chem. C. 7 (40): 12373—12387. doi:10.1039/C9TC03520F.
  10. ↑ Liu, J.; Liu, C.; He, W. (2013), Fluorophores and Their Applications as Molecular Probes in Living Cells, Curr. Org. Chem., 17 (6): 564—579, doi:10.2174/1385272811317060003
  11. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). Chapter 4 Fluorescent Labels. Fluorescence Microscopy in Life Sciences. Bentham Science Publishers. с. 96—134. ISBN 978-1-68108-519-7. {{cite book}}: |access-date= вимагає |url= (довідка)
  12. ↑ Omlc.ogi.edu
  13. ↑ а б в г Columbia Biosciences [Архівовано 2024-08-21 у Wayback Machine.]
  14. ↑ Bindels, Daphne S.; Haarbosch, Lindsay; van Weeren, Laura; Postma, Marten; Wiese, Katrin E.; Mastop, Marieke; Aumonier, Sylvain; Gotthard, Guillaume; Royant, Antoine (January 2017). mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods (англ.). 14 (1): 53—56. doi:10.1038/nmeth.4074. ISSN 1548-7105. PMID 27869816.
  15. ↑ Sirbu, Dumitru; Luli, Saimir; Leslie, Jack; Oakley, Fiona; Benniston, Andrew C. (2019). Enhanced in vivo Optical Imaging of the Inflammatory Response to Acute Liver Injury in C57BL/6 Mice Using a Highly Bright Near-Infrared BODIPY Dye. ChemMedChem (англ.). 14 (10): 995—999. doi:10.1002/cmdc.201900181. ISSN 1860-7187. PMID 30920173.
  16. ↑ Taki, Masayasu (2013). Chapter 5. Imaging and sensing of cadmium in cells. У Astrid Sigel (ред.). Cadmium: From Toxicology to Essentiality. Metal Ions in Life Sciences. Т. 11. Springer. с. 99—115. doi:10.1007/978-94-007-5179-8_5. PMID 23430772.
  17. ↑ Sirbu, Dumitru; Butcher, John B.; Waddell, Paul G.; Andras, Peter; Benniston, Andrew C. (18 вересня 2017). Locally Excited State-Charge Transfer State Coupled Dyes as Optically Responsive Neuron Firing Probes (PDF). Chemistry - A European Journal. 23 (58): 14639—14649. doi:10.1002/chem.201703366. ISSN 0947-6539. PMID 28833695.
  18. ↑ Jiang, Xiqian; Wang, Lingfei; Carroll, Shaina L.; Chen, Jianwei; Wang, Meng C.; Wang, Jin (20 серпня 2018). Challenges and Opportunities for Small-Molecule Fluorescent Probes in Redox Biology Applications. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (6): 518—540. doi:10.1089/ars.2017.7491. ISSN 1523-0864. PMC 6056262. PMID 29320869.

Зовнішні посилання

[ред. | ред. код]
Отримано з https://uk.wikipedia.org/w/index.php?title=Флуорофор&oldid=44112296