PCR (polymerasekjedereaksjon)

Polymerasekjedereaksjon brukes både innen medisinsk forskning, medisinsk diagnostikk og rettsmedisin. Ved hjelp av metoden kan man finne genvarianter og genfeil, bestemte DNA-fragmenter kan føres tilbake til bestemte individer, og spesifikke virus og bakterier kan identifiseres uten dyrking.

Under koronapandemien var en spesifikk PCR-metode, kjent som real-time revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR), avgjørende for hurtig diagnostikk av infiserte.

DNA er relativt stabilt og kan overleve svært lenge, iallfall som bruddstykker av enkelttrådet DNA. Med polymerasekjedereaksjon har man klart å oppkopiere DNA fra rester av organismer som er mange millioner år gamle. Dette har åpnet for nye perspektiver når det gjelder å studere artenes utvikling på Jorden.

Når man skal starte en PCR, lager man først en reaksjonsblanding som inneholder templat-DNA, primere og alle de fire byggesteinene (nukleotidene) i DNA-molekylet. Det tilsettes også et varmestabilt DNA-polymerase-enzym. En DNA-polymerase katalyserer eller igangsetter dannelsen av en DNA-tråd ved å lese av den komplementære DNA-tråden.

Reaksjonen foregår i tre trinn som gjentas 25–35 ganger (sykluser):

1. Ved første trinn klargjøres templat-DNA-et ved høy temperatur (94 °C). Temperaturen gjør at alt DNA-et blir enkelttrådet.
2. I trinn to senkes temperaturen, slik at primerne kan feste seg til de stedene på templat-DNA som har nøyaktig den komplementære sekvensen.
3. Temperaturen heves så til gunstige forhold for enzymet (rundt 72 °C), som så danner en ny DNA-tråd ut fra primerne med templat-DNA som mal.

Etter omtrent ett minutt har man dannet en kopi av hvert DNA-molekyl i prøven. Området som er kopiert, er begrenset på hver side av plasseringen til de to primerne. Etter at dette har skjedd én gang, varmes reaksjonen opp igjen slik at DNA deles til enkelttråder og hele prosessen gjentas.

PCR er nyttig fordi man lett kan gjenta denne reaksjonen et stort antall ganger (syklisk reaksjon). Ved tilstrekkelig mengde reagenser i reaksjonen vil man for hver syklus fordoble mengden DNA-kopier. Mengden av det ønskede DNA-segmentet øker altså eksponentielt.

Forandringen av temperaturen skjer automatisk i såkalte PCR-maskiner som kan programmeres slik at man kan variere temperatur og varighet av de enkelte trinnene.

Lengden på fragmentene kan undersøkes i en elektroforese for å bekrefte at det er riktig fragment som er kopiert. For å kunne gjøre dette må man vite hva slags lengde det er forventet at fragmentet skal ha, altså hvor mange basepar det inneholder. Fragmentene kan så sekvenseres, det vil si at man benytter seg av en teknikk for å lese av rekkefølgen på de ulike baseparene. Slik vil man for eksempel kunne undersøke om fragmentet koder for et spesifikt gen.

Ettersom PCR-metoden er så spesifikk og trenger så lite av utgangsmaterialet, kan det være mulig å få feilaktige resultater. Hvis det er forurensning i en prøve, altså at et annet DNA-materiale enn det man ønsker å undersøke finnes i prøven, kan feil type DNA kopieres. Dette kan føre til et falskt positivt svar. Et falskt positivt svar vil si at hvis man for eksempel ønsker å undersøke om det er en spesifikk type DNA-materiale til stede i en prøve eller ikke, kan man detektere DNA oppkopiert fra forurensingen og ikke fra det materialet man ønsker å identifisere. Da har man fått et falskt positivt svar. Dette kan for eksempel skje på et sykehuslaboratorium.

Hvis det finnes DNA-materiale fra en bestemt type DNA fra en bakterie og dette DNA-materialet har havnet i en reagens som brukes i PCR-reaksjonen, kan man detektere dette DNA-materialet selv om prøven som ble tatt ikke opprinnelig inneholdt DNA fra denne bakterien. Slik kan en pasient få påvist en infeksjon selv om pasienten i virkeligheten er frisk.

Det er strenge rutiner som skal forhindre at slike falske positive resultater forekommer. Et av disse tiltakene innebærer å bruke negative og positive kontroller i PCR-reaksjonen. En negativ kontroll kan være en PCR-reaksjon som kun består av reagensene som trengs til reaksjonen, uten prøvemateriale. Hvis DNA-materiale likevel påvises i denne negative kontrollen, er det et tegn på at en av reagensene er forurenset. PCR-reaksjonen må da gjøres på nytt med nye reagenser før prøvesvaret kan utgis.

På tilsvarende måte brukes en positiv kontroll for å undersøke at PCR-reaksjonen går riktig for seg. En positiv kontroll innebærer at man kjører en PCR-reaksjon på et prøvemateriale hvor man helt sikkert vet at DNA-materialet er til stede. Hvis DNA-et da ikke oppkopieres, må PCR-reaksjonen gjøres på nytt.

PCR-metoden ble oppfunnet av den amerikanske biokjemikeren Kary Banks Mullis. Han ble i 1993 tildelt Nobelprisen i kjemi for dette.

PCR-metoden fikk sitt gjennombrudd da man klarte å isolere et enzym som tåler høy varme, Taq-polymerase. Tidligere måtte man tilsette et nytt enzym ved hver eneste syklus fordi enzymet ble ødelagt ved oppvarming til 94 °C. Da Taq-polymerasen ble oppdaget i bakterien Thermus aquaticus og tatt i bruk i PCR-reaksjonen i 1988, ble metoden både mer effektiv og mer treffsikker. Det var fordi Taq-polymerasen kunne varmes opp til 95 °C flere ganger, og funksjonen til enzymet var meget stabilt ved høye temperaturer. Dette førte til at man kunne utnytte metoden i diagnostisk sammenheng.

• DNA-sekvensering
• DNA-sekvens
• funksjonell genomforskning
• microarray